蛋白酶K（Proteinase K），相對分子量約為29.3 kDa, 是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。可切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，應用廣泛，可用于制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶等實驗，蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg /ml。因蛋白酶K在變性劑如SDS（1%）中可提高其活性，所以在使用中，常根據所用緩沖液是否含有SDS、尿素、pH、溫度等因素確定具體的工作濃度。蛋白酶K在較廣的pH范圍內（pH 4-12.5）均有活性。
蛋白酶K有兩個Ca2+結合位點，它們離酶的活性中心有一定距離，與催化機理并無直接關系。然而，如果從該酶中除去Ca2+，由于出現遠程的結構變化，催化活性將喪失80%左右，但其剩余活性通常已足以降解在一般情況下污染核酸制品的蛋白質。所以，蛋白酶k消化過程中通常也加入EDTA（以抑制依賴于mg2+的核酸酶的作用）。但是，如果要消化對蛋白酶k具有較強耐性的蛋白，如角蛋白一類，則可能需要使用含有1mmol/l Ca2+而不含EDTA的緩沖液。在消化完畢后、純化核酸前要加入EGTA（ph8.0）至終濃度為2mmol/l，以鰲合Ca2+。